Zellaufschluss (cell disruption) - Zerstörung der Zellhüllen von Mikroorganismen, i. d. R. angewandt zur Gewinnung intrazellulärer Substanzen oder in der Biochemischen Analytik

Wofür wird die Stickstoff-Dekompression eingesetzt:

Mit welchen Zellen kann diese Methode angewandt werden:
Die Methode wird seit vielen Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt und erfährt seit einigen Jahren wieder starke Akzeptanz. Sie ist besonders für den Aufschluss von Säugetier- und anderen Membran-abgegrenzten Zellen geeignet [1,2,3,4,5]. Darüber hinaus wird die Methode erfolgreich an Pflanzenzellen [10] und empfindlichen Bakterien [7] angewendet. Auch wird die Methode sehr erfolgreich für die Ausschleusung von Viren aus befruchteten Eiern verwendet. Mit diversen Probenvorbehandlungen, durch die die Zellwände geschwächt werden (z.B.Verwendung von Muramidase), lassen sich selbst dickwandigere Bakterien aufschließen. Detailinformationen finden sich weiter unten [7].

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Wie funktioniert diese Methode:

Die Methode basiert auf dem Henry'schen Gesetz. Dieses beschreibt das Löslichkeitsverhalten von (flüchtigen) Substanzen in einer Flüssigkeit und besagt, dass die Konzentration der flüchtigen Substanz in der Flüssigphase direkt proportional zum Partialdruck über der Lösung ist ( siehe auch Link auf Wikipedia - Henry-Gesetz oder Chemgapedia - Henry Gesetz ).
Das bedeutet, dass unter erhöhtem Gas-Druck das Gas in die Zellen diffundiert und sich dort anreichert. Bei schlagartiger Druckentlastung kann das innerhalb der Zellen gelöste Gas nicht schnell genug entweichen und "perlt" innerhalb der Zellen in Form von größer werdenden Gasbläschen aus. Die dadurch größer werdende mechanische Belastung für die Zellmembran führt schließlich zu einem Platzen dieser, wodurch der Zellinhalt freigesetzt wird.
Bestimmt wird der Grad des Zellaufschlusses dabei von folgenden Faktoren:

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Wie wird diese Methode angewandt:

Die aufzuschließenden Zellen werden nach möglichen Vorbehandlungen üblicherweise in Pufferlösungen suspendiert und anschließend in einem Druckbehälter aus Edelstahl platziert. Dabei kann die Zellsuspension entweder direkt in den Druckbehälter gefüllt werden oder in ein Reagenzglas, welches in den Druckbehälter gestellt wird. Anschließend wird der Behälter geschlossen und mit Druck beaufschlagt. Dies kann unter anderem mit Stickstoff aus einer handelsüblichen N2-Druckflasche erfolgen. Über einen Druckminderer kann der Druck innerhalb des Druckbehälters auf den gewünschten Wert eingestellt werden. Ein angebrachtes Manometer zeigt den Druck an, der auf die Zellsuspension und damit auf die Zellen wirkt. In Abhängigkeit von den Zellen und dem gewünschten Zellaufschlussgrad werden üblicherweise Drücke bis 90bar verwendet. Eine Kühlung des Druckbehälters und seines Inhaltes ist z.B. mittels Eis jederzeit möglich. Indem man den Druckbehälter auf eine Rührplatte stellt, kann die Zellsuspension über die gesamte Versuchsdauer hinweg gerührt werden.
Nach einer Wartezeit, die üblicherweise zwischen 5 und 30 Minuten beträgt, wird der Druck durch Öffnen eines Ventils abgelassen. Der eigentliche Zellaufschluss passiert beim Durchgang der Zellen durch das Ventil aus dem Inneren des Druckgefäßes in die Atmosphäre. Eine hohe Strömungsgeschwindigkeit am Ventil hat dabei keinen Einfluss auf den Zellaufschluss und ist somit nicht nötig. Die Zellsuspension mit den aufgeschlossenen Zellen kann am Ventil z.B. in einem Glaskolben aufgefangen und der nachfolgenden Analyse zugeführt werden.

Wie können Bakterien mit der Stickstoff-Dekompressionsmethode aufgeschlossen werden:
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Zellwände von Bakterien mittels Stickstoff-Dekompression aufzubrechen:
(1) Man führt den Aufschluss an Bakterien durch, die sich in einem frühen Wachstumsstadium befinden und dementsprechend noch keine voll ausgebildete Zellwand aufweisen.
(2) Man lässt die Bakterien in Anwesenheit von Wirkstoffen wachsen, die die Bildung der Zellwände verhindern und/oder hemmen.
(3) Man schwächt vor dem eigentlichen Aufschluss die Zellwände mit bestimmten Enzymen (z.B. Lysozym).
(4) Vor dem Aufschluss werden die Zellwände durch eine mechanische Vorbehandlung geschwächt.

Warum verwendet man üblicherweise Stickstoff:
Obwohl man für die Dekompressionsmethode verschiedene Gase verwenden kann (CO2, CO, komprimierte Luft), hat sich Stickstoff als verwendetes Gas durchgesetzt, da es inert ist und somit einen vorzüglichen Schutz gegen Oxidationsreaktionen an den empfindlichen Zellbestandteilen bietet. Darüber hinaus verändert es den pH-Wert der Suspensionslösungen nicht. Weitere Vorteile sind der niedrige Preis und die gute Verfügbarkeit von Stickstoff in handelsüblichen Druckgasflaschen (z.B. www.linde-gase.de).

Anwendungen aus der Literatur:
Hunter und Commerford [1] veröffentlichten bereits 1961 Ihre Untersuchungen zum Aufschluss von Säugetier-Gewebe mittels der Stickstoff-Dekompressionsmethode. Mit ihren Untersuchungen an verschiedensten Gewebeproben von z.B. Ratten, der Milz, von Leukozyten, Lymphknoten, Tumoren und diversen anderen Geweben bestätigen die Autoren das breite Anwendungsfeld dieser Zellaufschlussmethode. Bei Drücken bis 89 bar ermittelten Sie einen kompletten Zellaufschluss. Bei Drücken von 55 bis 70 bar erhielten Sie Zell-freie Homogenate mit intakten Zellkernen. Bei Drücken unterhalb von 48 bar blieben ganze Zellen und Zell-Aggregationen erhalten.
Dowben, Gaffey und Lynch [2][3] wendeten die Stickstoff-Dekompressionsmethode an folgenden Zelltypen an: Fibroblasten, menschliche Fötalzellen aus Fruchtwasser, Leber-Zellen von Ratten und Muskelzellen von Hühner-Embryos. Bei Drücken von 41 bar konnten 99,9% der Zellen aufgeschlossen werden. Dabei blieben 95% der Zellkerne intakt. Im Vergleich zu mechanischen Aufschlussmethoden war die Ausbeute an Polyribosomen ca. 2 bis 3-mal größer.
Short, Maines und Davis [4] verglichen die Ergebnisse aus Stickstoff-Dekompressionsmethode und Potter-Elvehjem-Homogenisator mit Glas- und Teflonpistill an der Präparation von Mikrosomal-Fraktionen für Untersuchungen zur Verstoffwechselung von Drogen. Mittels der Dekompressionsmethode konnten die Autoren mehr als doppelt soviel Protein präparieren als mit der Pistill-Methode bei vergleichbaren Enzymaktivitäten. Mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Dekompressionsmethode entgegen der Pistllmethode zu Zell-freien und einheitlicheren Homogenaten geführt hat.
Wallach et. al. [5] konnten mittels Stickstoff-Dekompression komplette Zell-Fraktionen mit minimalen Schäden an den Zellkernen durchführen. Die Autoren arbeiteten an Ehrlich-Ascites-Tumorzellen, suspendiert in einer 0,0002M Magnesium-Acetat-Pufferlösung, und untersuchten die zellulare Verteilung von Phospholipiden.
Fraser [7] veröffentlichte einige der frühesten Untersuchungen zur Stickstoff-Dekompression und deren Einfluss auf Bakterien des Typs E. coli. Obwohl er nur mit Drücken bis 65 bar arbeitete, konnte der Autor bereits beim ersten Durchgang 75% der Zellen aufschließen. Nach einem weiteren Aufschluss konnte er schließlich 90% der E. coli Bakterien, die er während deren Wachstumsphase entnahm, aufschließen. In der Veröffentlichung werden auch die Ergebnisse zum Aufschluss anderer Bakterien und Organismen beschrieben.
Loewus und Loewus [10] verfassten diverse Artikel, in denen sie ihre Untersuchungen zum Zellaufschluss von Pflanzenzellen mittels der Stickstoff-Dekompressionsmethode beschreiben. In diesen beschrieben Sie auch den erfolgreichen Aufschluss von Algen.

Weitere Hinweise - auch neue Literatur - finden Sie bei www.google.de (Suchbegriffe bereits angegeben).

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Was sind die Vorteile dieser Methode:

- Es ist eine schonende Methode zur Homogenisierung und Fraktionierung von Zellen, da die chemische und physikalische Belastung, die auf die inneren Zellbestandteile wirkt, nur gering sind.
- Mechanische Aufschlussverfahren führen aufgrund von Scherbeanspruchung und Reibung an den Zellen meist zu einem Temperaturanstieg, der in Abhängigkeit der Temperatur nicht nur die Funktion von Proteinen beeinträchtigen sondern auch zu Denaturierung dieser führen kann. Dem entgegen kommt es bei dem Dekompressions-Aufschluss aufgrund der stattfindenden adiabatischen Expansion zu einer Abkühlung der Probe. Zusätzlich kann die Probe während des Aufschlusses mittels Eis direkt oder indirekt gekühlt werden.
- In seiner Funktion als Schutzgas bietet ein inertes Gas, wie z.B. Stickstoff, einen herausragenden Schutz gegen Oxidationsreaktionen an empfindlichen Zellbestandteilen.
- Die Auswahl der Suspensionslösung richtet sich lediglich nach deren Verträglichkeit für die Zellbestandteile. Dies führt zu einer großen Variabilität bei der Auswahl des Suspensionsmediums.
- Der Grad der Zell-Fraktionierung kann einfach über den Druck des zu verwendenden Gases eingestellt werden. Ein hoher Druck führt zu einer starken Anreicherung des Gases innerhalb der Zelle und damit nach der Druckentspannung zu einer vollständigen Homogenisierung. Mit moderaten Drücken verringert sich während und nach der Druckentspannung die mechanische Belastung der Zellwand. Zellkerne, aktive Mitochondrien und andere Organellen bleiben dabei intakt.
- Subzelluläre Komponenten, wie z.B. Zellkerne und Mitochondrien, die aufgrund ihrer geringen Größe nur schwer zu homogenisieren sind, können über Einstellen des Druckes ebenfalls homogenisiert werden.
- Sobald die Zelle aufgebrochen ist, werden die Zell-inneren Komponenten keiner weiteren mechanischen Belastung durch Reibung ausgesetzt, die im Extremfall zu Denaturierung und unerwünschter Schädigung der Organellen führen kann.
- Die Methode ist einfach anzuwenden und führt üblicherweise innerhalb von 20 Minuten unabhängig von der Probengröße zu einheitlichen und wiederholbaren Ergebnissen.
- Mit dieser Methode erhält man einheitliche Proben, da auf alle Zellen innerhalb der Probe die gleiche mechanische Belastung durch das Ausperlen des Gases wirkt.
- Geringe Investitionskosten

Was sind die Nachteile dieser Methode:
- Nur relativ leicht aufzubrechende Zellen können mit dieser Methode effektiv aufgeschlossen werden. So können z.B. E. coli, Hefen, Pilze und Sporen direkt nur ungenügend oder nicht aufgeschlossen werden. Derartige Zellen müssen mittels diverser nicht-mechanischer Verfahren aufgeschlossen werden.
- Bei unsachgemäßer Anwendung führen die höheren Gasdrücke zu einem gewissen Gefährdungspotential.
- Die Anwendung in größerem Maßstab ist aufgrund der benötigten hohen Gasdrücke nicht mehr praktikabel.

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Welches Equipment braucht man für diese Methode:

- Druckbehälter (Kopf und Zylinder, Verschluss) = Zellaufschlussbombe mit Manometer und Ventil (Synonyme: Zellaufschlussgefäß, Zellaufschlussgerät, Zellaufschlussbehälter)
- Stickstoff-Druckgasflasche mit Druckminderer
- Auffanggefäß (z.B. Doppelhalskolben, evtl. Reagenzgläser)

Parr
Zellaufschlussbomben

Zellaufschlussbomben sind in 5 Standardgrößen erhältlich, für Drücke bis max. 207 bar und Probengrößen von weniger als 1 ml bis 5 Liter ausgelegt. Durch Zukauf von Konversions- Sets (Zylinder und Entnahmerohr) können die Zellaufschlussgeräte 4635 (920ml) auf 4636 (1.850ml) und das Modell 4637(3.750ml) auf 4638 (7.500ml) erweitert werden. Preise wie auch technische Modifikationen auf Anfrage.

Eine mögliche Modifikation der Zellaufschlussbombe stellt der Einsatz eines Magazins für mehrere Reagenzgläser in den Zylinder dar. Die Magazine können für unterschiedliche Zahlen von Reagenzgläsern hergestellt werden. In jedes Glas reicht ein Probenentnahme- bzw. -ablassrohr, das die jeweiligen Zellbestandteile bei der Entspannung nach außen transportiert. Dieses Verfahren erlaubt einen gleichzeitigen Aufschluss von mehreren Proben z.B. unterschiedlicher Suspensionen.

Grundausstattungen der Zellaufschlussgeräte in T316 Edelstahl mit Gaseinlass- und Gasauslassventil, Manometer, Berstscheibe (nicht bei 4639), Stickstofffüllverbindung mit Druckminderer, Ersatzdichtung.

Zellaufschlussbomben - Übersicht
max. empfohlener Arbeitsdruck 152 bar

Art.Nr. Volumen max. Probengröße
4635 920 ml 600 ml
4636 1.850 ml 1.200 ml
4637 3.750 ml 2,5 Lit.
4638 7.500 ml 5,0 Lit.
4639 45 ml 30 ml
* ohne Berstscheibe

Weitere Details siehe www.parrinst.de

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Literaturstellen:

[1] Hunter, M.J. and Commerfold, S.L., 1961, "Pressure homogenization of mammalian tissues" Biochim. Biophys. Acta, 47:580-586.
[2] Dowben, R.M., Gaffey, T.A. and Lynch, P.A., 1968, "Isolation of liver muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation" FEBS Letters, Vol. 2, No. 1, 1-3
[3] Dowben, R.M., Lynch, P.M., Nadler, H.C. and Hsia, D.Y., 1969, "Polyribosomes from L. Cells" Exp. Cell Research, 58:167-169
[4] Short, C.R., Maines, M.D. and Davis, L.E., 1972, "Preparation of hepatic microsomal fraction of drug metabolism studies by rapid decompression homogenization" Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 140:58-65
[5] Wallach, D.F.H., Soderberg, J. and Bricker, L., 1960, "The phospholipids of Ehrlich and ascites carcinoma cells composition and intracelfular distribution" Cancer Research, 20:397-402
[6] Manson, L.A., Foshi, G.V. and Palm, J., 1963, "An association of transplantation antigens with microsomal pipoproteins of normal and malignant mouse tissues" J. Cell and ComD. Physiol., 61:109-118
[7] Fraser, D., 1951, "Bursting bacteria by release of gas pressure" Nature, 167:33-34 [8] Avis, P.J.G., 1967, "In subcellular components, preparation and fractionation" (Ed. Birnie, G.D. and Fox, S.M.) Kap. 1, Pressure homogenization of mammalian cells, veröffentlicht von Plenum Press, New York
[9] Manson, L.A., 1972, "Extraction of membranous transplantation antigens by pressure homogenization" (Ed. Kahan, B.D. and Relifeld, R.A.) Kap. 9, Transplantation Antigens, veröffentlicht von Academic Press, New York
[10] Loewus, M.W. and Loewus, F., 1971, "The isolation and characterization of d-glucose 6-phospate-cycloaldolase (NDA dependent) from acer pseudoplatanus L. cell cultures" Plant Physiol. (1971), 48:255-260

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